Approfondimenti molecolari sulla biogenesi delle proteine ​​di ancoraggio del glicosilfosfatidilinositolo

Nature Communications volume 13, numero articolo: 2617 (2022) Citare questo articolo

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Le cellule eucariotiche sono rivestite con un'abbondanza di proteine ​​di ancoraggio del glicosilfosfatidilinositolo (GPI-AP) che svolgono un ruolo cruciale nella fecondazione, nella neurogenesi e nell'immunità. La rimozione di un peptide segnale idrofobo e l'attacco covalente di GPI al nuovo terminale carbossilico sono catalizzati da un complesso GPI transamidasi della membrana del reticolo endoplasmatico (GPI-T) conservato in tutti gli eucarioti. Qui, riportiamo la struttura della microscopia crioelettronica (crio-EM) del GPI-T umano con una risoluzione globale di 2,53 Å, rivelando un assemblaggio eteropentamericano equimolare. La mutagenesi basata sulla struttura suggerisce un meccanismo simile a quello delle leguminose per il riconoscimento e la scissione dei substrati proproteici, e un GPI endogeno nella struttura definisce una cavità composita per il substrato lipidico. Questo sito attivo allungato, che deriva dalla membrana e si estende per uno spazio aggiuntivo di circa 22 Å verso la diade catalitica, è strutturalmente adatto per entrambi i substrati che presentano un modello anfipatico che corrisponde a questa geometria. Il nostro lavoro presenta un passo importante verso la comprensione meccanicistica della biosintesi GPI-AP.

L'ancoraggio GPI rappresenta una modifica post-traduzionale onnipresente e metabolicamente costosa delle proteine ​​della superficie delle cellule eucariotiche1,2,3,4,5. Strutturalmente chiariti negli anni '806, i lipidi GPI sono bioattivi7 e chimicamente diversi con una struttura portante minima costituita da un gruppo fosfatidilinositolo legato a un nucleo polisaccaridico α-Man3-(1 → 2)-α-Man2-(1 → 6)-α-Man1 -(1 → 4) -α-GlcN (Man1/2/3, i tre mannosi; GlcN, glucosamina; i numeri tra parentesi indicano la numerazione del carbonio) (Fig. 1a, Figura 1a supplementare). Il nucleo glicano nel GPI maturo trasporta gruppi funzionali aggiuntivi, alcuni dei quali sono specifici per specie e tessuto. Il processo di maturazione coinvolge più enzimi tra cui mannosil transferasi e fosforiletanolammina (EtNP) transferasi (Figura 1b supplementare)2,3,4. L'EtNP su C2 di Man1 è un prerequisito per l'aggiunta enzimatica di Man38,9, dopo di che il passaggio due EtNP vengono trasferiti sequenzialmente a C6 di Man3 (come collegamento per l'ancoraggio del GPI) e Man2 (per un efficiente reticolo endoplasmatico (ER)-Golgi trasporto di alcuni GPI-AP)2. La mannosilazione di Man3 in C2 è essenziale per l'ancoraggio del GPI in alcune specie come i lieviti10. In alcune specie di Trypanosoma, C3 di Man2 e C3/C4 di Man1 possono avere ulteriori decorazioni saccaridiche e C6 di GlcN è modificato con un amminoetilfosfonato (riassunto nel rif. 11) (Figura 1a supplementare). Per quanto riguarda la parte del fosfatidilinositolo, una catena acilica è solitamente presente in C2 dell'inositolo prima dell'ancoraggio del GPI (Figura 1a supplementare) ma nella maggior parte dei casi (eccetto negli eritrociti) viene rimossa immediatamente dopo l'attacco del GPI3. Infine, anche la catena grassa del gruppo fosfatidilico subisce un rimodellamento sia prima (Figura 1b supplementare) che dopo la fase di attacco GPI, causando diversità acilica come diacilglicerolo, alchilacilglicerolo o ceramidi con lunghezza e insaturazione variabili2,3,4,11 .

un GPI-T sostituisce il peptide segnale C-terminale (CSP) delle proproteine ​​con GPI sul residuo ω (blu) mediante una reazione di transaminazione. Varie parti sono indicate nella casella tratteggiata. EtNP, etanolamina fosfato; L'uomo, mannosio; Ino, inositolo; GlcNH2, glucosamina. Le preferenze per i siti ω, ω+1, ω+2 e ω+3 sono indicate nel riquadro tratteggiato con l'amminoacido abbreviato con singole lettere. L'ombreggiatura grigia indica la membrana del reticolo endoplasmatico (ER). b GPI-T mostra un picco quasi gaussiano sulla filtrazione su gel e tutte e cinque le subunità sono presenti su una SDS-PAGE (riquadro) visualizzata mediante fluorescenza nel gel (a sinistra) e colorazione Coomassie (a destra). Vo e Vt (triangolo) indicano rispettivamente il vuoto e il volume totale. I segnali di assorbanza di fondo prima di Vo non vengono visualizzati completamente. G/T/S/K/U si riferisce alle subunità GPAA1/PIGT/PIGS/PIGK/PIGU. La posizione di ciascuna subunità è stata determinata separatamente confrontando il complesso con subunità espresse singolarmente. Un asterisco indica un contaminante minore. I pesi molecolari dei marcatori proteici sono indicati a destra. Viene mostrato un risultato rappresentativo di tre esperimenti indipendenti. Le immagini non ritagliate vengono fornite nei dati di origine. c Mappa Cryo-EM (i-iii) e vista normale del dominio transmembrana dal lume dell'ER (iv) o dal citosol (v). I numeri in iv e v indicano che TMH e G/T/U/S/K si riferiscono rispettivamente a GPAA1 e PIGT/U/S/K. Lipidi e detergenti sono visualizzati come bastoncini (grigi). Le subunità e le densità crio-EM associate sono codificate a colori come indicato.