Caratterizzazione del metabolismo dei lipidi dell'inositolo nell'intestino

Nature Microbiology volume 7, pagine 986–1000 (2022)Citare questo articolo

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I lipidi dell’inositolo sono onnipresenti negli eucarioti e hanno ruoli finemente sintonizzati nella segnalazione cellulare e nell’omeostasi della membrana. Nei batteri, tuttavia, la produzione di lipidi inositolo è relativamente rara. Recentemente, è stato segnalato che il prominente batterio intestinale umano Bacteroides thetaiotaomicron (BT) produce lipidi di inositolo e sfingolipidi, ma i percorsi rimangono ambigui e la loro prevalenza poco chiara. Qui, utilizzando approcci genomici e biochimici, abbiamo studiato il cluster genetico per la sintesi dei lipidi dell'inositolo in BT utilizzando un ceppo precedentemente non descritto con controllo inducibile della sintesi degli sfingolipidi. Abbiamo caratterizzato la via biosintetica dalla sintesi del mio-inositolo-fosfato (MIP) alla fosfoinositolo diidroceramide, determinato la struttura cristallina dell'enzima ricombinante BT MIP sintasi e identificato la fosfatasi responsabile della conversione del fosfatidilinositolo fosfato di origine batterica (PIP-DAG) in fosfatidilinositolo (PI-DAG). In vitro, la perdita della produzione di lipidi di inositolo ha alterato l’espressione della capsula BT e la resistenza ai peptidi antimicrobici. In vivo, la perdita di lipidi di inositolo ha ridotto la fitness batterica in un modello murino gnotobiotico. Abbiamo identificato un secondo percorso putativo, precedentemente non descritto, per la sintesi batterica PI-DAG senza un intermedio PIP-DAG, comune in Prevotella. I nostri risultati indicano che la produzione di sfingolipidi inositolo è diffusa nei Bacteroidetes associati all'ospite e ha implicazioni per la simbiosi.

L'inositolo, uno zucchero carbociclico abbondante negli eucarioti, costituisce la base per diversi fosfati di inositolo messaggeri secondari fosforilati e lipidi di inositolo. Nella loro forma più semplice, i lipidi dell'inositolo hanno l'inositolo come gruppo principale polare, ad esempio il fosfatidilinositolo (PI-DAG; struttura glicerofosfolipidica; Fig. 1a) o l'inositolo fosforilceramide (struttura sfingolipide). La testa dell'inositolo può essere ulteriormente modificata, inclusa la fosforilazione del PI-DAG per formare fosfoinositidi bioattivi o l'aggiunta di un mannosio agli sfingolipidi dell'inositolo per formare le fosforilceramidi del mannosilinositolo abbondanti nel lievito1,2. I derivati dell'inositolo controllano i processi chiave della fisiologia delle cellule eucariotiche. Ad esempio, sebbene i fosfoinositidi costituiscano una piccola frazione dei fosfolipidi complessivi, sono essenziali per marcare l'identità degli organelli, regolare le interazioni citoscheletro-membrana e controllare la divisione cellulare e l'autofagia3,4.

a, La via metabolica della sintesi de novo degli sfingolipidi in relazione alla sintesi dei lipidi dell'inositolo, con gli enzimi BT studiati in questo studio (in grassetto nero) e strutture lipidiche rappresentative, con lunghezza della catena e ramificazione che riflette le strutture predominanti determinate dall'analisi dell'estere metilico degli acidi grassi (vedere Supplementare Informazioni, Figure supplementari 1 e 2 e Tabella 6). I modelli di ramificazione dei lipidi a base di diidroceramide sono previsti ma non confermati. Le strutture degli sfingolipidi sono denominate in viola e mostrate su sfondo azzurro; le strutture dei glicerofosfolipidi sono denominate in verde su sfondo grigio. I lipidi dell'inositolo sono delineati con una casella con linea tratteggiata. SPT, serina palmitoiltransferasi. b, La regione genomica dell'inositolo BT e della sintesi dei lipidi dell'inositolo, con numerazione cromosomica (mostrata con orientamento inverso). Il colore del gene (blu o rosso) indica l'appartenenza a un operone previsto da BioCyc. Le annotazioni riguardano le funzioni enzimatiche chiarite in questo studio (a causa della mancanza di un fenotipo lipidico nel suo ceppo knockout, BT_1524 rimane ipotetico). Substrati e prodotti per la porzione sfingolipide di a non sono elencati, poiché queste reazioni (oltre all'SPT) non sono state caratterizzate nei Bacteroidetes.

Nonostante l’ampia distribuzione dei lipidi di inositolo negli eucarioti, si sa poco circa la struttura e la distribuzione dei lipidi di inositolo nei batteri. I lipidi dell'inositolo batterico sono relativamente rari e in precedenza si riteneva che fossero limitati in gran parte alla sintesi PI-DAG negli actinobatteri (ad esempio micobatteri, corinebatteri e streptomiceti)5,6,7 e spirocheti (Treponema)8. Nel Mycobacterium tuberculosis, un patogeno intracellulare obbligato, le teste di inositolo del PI-DAG collegano i fattori di virulenza degli oligosaccaridi di superficie alla membrana esterna9.

1.5 and exclude those with maximum absolute log2-fold-change difference in expression <1.5 in all pairwise comparisons of conditions. The tree above the expression data represents the Euclidean column clustering defining the sample order by expression similarity. Colour in the far right column indicates gene assignment to one of 8 CPS loci. Strains tested include WT BT, iSPT, ΔBT_1522 and iSPTΔBT_1526 in the iSPT background. SPT induction in the iSPT strains at 0, 0.2, 1.0, 5.0 or 100 ng ml−1 aTC induction is indicated in shades of grey. Labels below each column indicate strain, induction level and replicate ID according to the following pattern: ‘(strain) - (aTC induction in ng ml−1) (replicate A/B)’. Blue and pink shading emphasizes replicates from the ΔBT_1526 and ΔBT_1522 strains, respectively. b, Percent abundance of inositol among total glycosyl residues detected in each WT and inositol lipid knockout strain (n = 3 biological replicates per strain tested; means ± s.d.). Legend and data colours are the same as in c and d. Full capsule analysis (lipids and glycosyl residues) are available in Extended Data Fig. 6. c, IC50 (n = 2 biological replicates per strain) for each WT and BT inositol lipid knockout strain in minimal medium supplemented with the cationic antimicrobial peptide LL-37. Data are representative of two experiments and represented as mean ± s.d. One-way ANOVA F(5,6) = 35.5; P = 0.0002; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, ***P ≤ 0.001. WT vs ΔBT_1523 P = 0.0124; WT vs ΔBT_1525 P = 0.0007; WT vs ΔBT_1526 P = 0.0016. d, Caecal BT colonization of mice after 14 d bacterial association. Copies of BT (c.f.u.-equivalents quantified by qPCR analysis of BT_1521 copy number) present in mouse caecal contents after 14 d strain association. One-way ANOVA F(3,28) = 5.6; P = 0.004; Tukey’s multiple comparisons: *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01 (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicate measurements). WT vs ΔBT_1526 P = 0.0496; ΔBT_1522 vs ΔBT_1523 P = 0.0480; ΔBT_1523 vs ΔBT_1526 P = 0.0050. Normality of data distribution was confirmed using the D’Agostino-Pearson test at alpha = 0.05. e, Percent abundances of WT in the combined WT + ΔBT_1523 population in the initial inoculum (n = 1, mean of 3 technical replicates) and in the caeca of 8 gnotobiotic mice following a 14 d colonization (n = 8 mice; each point is the mean of 3 technical replicates per mouse). The black line indicates the median of the WT BT abundance in mouse caeca following the competition experiment (73.0%)./p>100 glycosyl residues can be bound to a single lipid-linked inositol44,45. However, the low inositol abundance in our capsule analysis lacks enough statistical power to determine this unequivocally in BT. The CPS loci expressed by BT, and differentially expressed when MIPS is deficient, have been shown to influence recognition by the host adaptive immune system and bacteriophage29,46. The strong effect of MIPS deficiency on transcription of capsule-related genes may therefore indicate an indirect role for inositol on cross-kingdom interactions./p>20 mg l−1 of E. coli culture./p>1.5./p> 0.05. In the RNA-seq experiment, P values were calculated from empirical Bayes moderated t-statistics and adjusted according to the Benjamini-Hochberg method; only significantly differentially expressed genes with >1.5 absolute log2 fold change are reported. The ‘n’ reported in each experiment represents an individual biological replicate for the relevant experiment (for example, mouse caecal sample, bacterial culture). No statistical methods were used to pre-determine sample sizes, but our sample sizes are similar to those reported in previous publications51. Data collection and analysis were not performed blind to the conditions of the experiments. No animals or data were excluded from the analyses. In mouse experiments, mice were randomly assigned to a treatment condition to randomize age and litter of origin. For in vitro experiments, following strain generation, identical treatments were performed (for example, lipid extraction and analysis, capsule extraction and analysis, AMP resistance and growth curves) so randomized allocation was not necessary. TLC experiments were repeated independently at least two times with similar results./p>